三维成像和非焦平面外成像

三维成像

利用综合可视化模型协助研究

 

对所有生物样本进行三维成像,从细胞器到细菌、多层体细胞、组织切片及小的模式生物体。荧光显微镜技术拥有优异性能,可以用于处理经特殊标记的蛋白质、结构及细胞器。然而,当您在样品内对这些目标进行成像时,焦平面的上下两个方向会发射出荧光,之后会被物镜捕获。这种效应会使获得的图像模糊,降低分辨率。诸如光学切片等出色的三维成像方法能帮助您从荧光样品中获取出色的三维图像。一般而言,三维成像技术依赖于数学算法、光学硬件或两者结合来消除或极大限度地减少非焦平面外的荧光。

在光学显微镜下使用光学切片的三维成像技术

  • 去卷积是一种基于数学模型的三维成像方法。通过去卷积计算方法将杂散光重新投射回其原点来恢复模糊图像。使用焦平面和非焦平面外发射的所有荧光信号,因此这项光学切片法非常灵敏且特别适用于微弱荧光样品和活体细胞成像。借助 ZEN软件中 去卷积(Deconvolution)模块,您可以轻松实现宽场荧光图像的光学切片。
  • ApoTome.2 结构照明技术是基于将栅格结构投影在焦平面同时在一定范围内准确移动。专利算法则是利用至少三张具有不同栅格位置的单幅图像计算出高解析度的光学切片图像。采集组织切片和整个生物的多通道三维图像,仅需将 ApoTome.2 插入蔡司显微镜的视场光阑位置即可获得令人惊叹的三维成像效果。
  • 孔径相关(Aperture correlation)综合了结构照明的光效率和 VivaTome 转盘的高速度。激发光与发射光通过带有栅格的旋转圆盘达到共轭平面。由于转盘优化了激发光透射,因此借助普通白光光源便能实现高光效率。来自焦平面的发射光与 50% 非焦平面的发射光一起通过转盘并被检测到。另外 50% 的非焦平面的发射光则被转盘反射,在捕获后用于创建第二幅图像。两幅图像相减即可得到光学切片图像。因此,您可以使用 VivaTome 的孔径相关原理对动态过程进行高帧率和高对比度成像。
  • 共聚焦显微镜技术 则使用发射光光程共轭平面内的点光源和针孔来抑制非焦平面的杂散光。这项技术是一款用于较厚样品成像的强大工具,并能在 z 轴方向上获得高分辨率。然而,其对于无法发出足够亮荧光信号的样品是个挑战。蔡司激光扫描显微镜 LSM 710LSM 780 配备具有 45% 量子效率的高灵敏探测器。借助出色的信噪比和较短的曝光时间,甚至可实现高难度样本成像。选用 Cell Observer SD 可以快速、柔和地监测活体样本。此三维成像解决方案采用了转盘技术,利用转盘上的多个针孔以超高采集速度获取三维共聚焦图像。
  • 选择性激发是指仅激发所需焦平面内的荧光基团来创建光学切片。 这可使用 LSM 7 MP 多光子显微技术或 LSM 710NOL 和 780NLO 非线性附件来实现。若使用红外范围内的低能量波长,则需两个光子激发荧光基团。因此,主要在激光束密集聚焦的焦平面内产成荧光。另外,由于使用了较长的激发波长,所以降低了散射和光损伤。在无光漂白和无光毒效应时,甚至可以获得 1 毫米深度的图像。激光层照荧光显微技术(LSFM)是另一种使用选择性激发的技术。  激发光光路与发射光光路分离,且仅照射样本的焦平面。利用 MultiView 成像和培养装置,Lightsheet Z.1 能够轻松在长达几小时甚至数天内监测胚胎和器官组织发育。

三维超高分辨率显微技术

超高分辨率结构照明显微技术(SR-SIM)是一种用于实现三维采集的通用、灵活荧光技术。相干激光的一个非常精细的相位栅格在样品上旋转和移动,用以激发荧光基团。通过样品结构栅格的干涉条纹,在叠加照明栅格后生成第三种图案。它会比样品小结构产生的精细图案要宽,因此可由透镜发射。然后从这些信息中计算出超高分辨率图像。通过这种方法可以提高横向,尤其是轴向的分辨率。ELYRA S.1 和 ELYRA PS.1 能够实现任一传统荧光基团的三维成像。分辨率是传统光学显微镜的两倍,并通过 z 轴切片实现三维图像采集。

电子显微镜三维成像

扫描电子显微镜能以惊人的分辨率对生物微观结构成像,并与三维成像组合使用。  使用树脂包埋样品,然后在样品室内使用超薄切片机对样品进行切片。在每次切片后对样品块成像,并生成一系列电子显微镜图像,然后组合成最终的三维数据集。这一技术也被称为系列连续切片成像技术(SBF-SEM),蔡司扫描电子显微镜可以提供。 MERLIN 3ViewSIGMA 3View 中充分利用了 Gatan 公司研制的简便、快捷的 SBF-SEM 技术。另一种实现方法则是使用聚焦离子束,运用在蔡司 FIB-SEM 系统,用以磨蚀样本表面并借助 ATLAS 3D 软件进行重构。超薄切片机是一种更快速的方法,而聚焦离子束则能实现更精细的样品切割。

教程初始化时,会在宽场图像(Widefield Image)窗口内显示样本的伪彩宽场图像,在原始图像(Raw Image)窗口内显示其灰度图。操作时,点击自动播放(AutoPlay)按钮或使用鼠标点击一个调节角度(Modulation Angle)。不同的栅格方向也会被叠加显示在原始图像上,相关功率谱则出现在傅里叶光谱(Fourier Spectrum)窗口中。一旦采集了全部 5 幅图像,则会在超高分辨率 SIM 图像(Superresolution-SIM)窗口中显示高分辨率重构图像。

 

教程:超高分辨率结构照明显微技术
折叠

推荐用于三维成像的产品: