蔡司 Lightsheet 7

激光片层扫描显微系统助您实现活体和透明化样品多视角成像

 

生命科学研究可能会对您的成像能力提出很高的要求,有时甚至需要您对整个活体模式生物、组织或细胞的发育过程进行成像。由于采用独特的照明原理,激光片层扫描显微系统(LSFM)非常适合对此类样品进行快速而柔和地成像。蔡司Lightsheet 7具备良好的稳定性,远胜以往显微镜的低光毒性,让您能够在较长时间内观察活体样品,甚至达到数天。除此之外,您还可以利用此项技术以亚细胞分辨率对大尺寸透明化样品进行完整成像。利用专用的光学器件、样品仓和样品夹增强Lightsheet 7的性能,以准确地匹配您所选的透明化方法的折射率,对您的大样品进行成像,甚至是整个鼠脑。这些灵活的特性均来自于蔡司成熟且稳定的箱式光片设计。

优势

  • 透明化样品成像

您所选择的透明化方法将取决于您要成像的组织类型、荧光标记物以及样品本身的大小。蔡司Lightsheet 7设计用于匹配所有这些不同条件。您可以在几乎所有透明化溶液中对折射率从1.33到1.58之间,最大尺寸为2 cm的样品进行成像。稳定的一站式Lightsheet 7成像系统,即可以帮助您以亚细胞分辨率获取整个样品的图像和数据。无论是透明化的类器官、细胞团、器官、脑还是其它样品,Lightsheet 7显微镜都是您实现快速柔和的LSFM成像的理想之选。

 

灌注 PBS、CellTracker™ CM-DiI 染料和4% PFA的C57 BL6J小鼠。使用iDISCO+方法进行透明化处理,最终RIMS为肉桂酸乙酯。

样品由美国马萨诸塞州剑桥市Divinity大道16号2052室哈佛大学哈佛生物成像中心(邮编02138)的Erin Diel提供

  • 获得更好的图像质量和稳定性

操作便捷的Lightsheet 7,可以让您的LSFM成像更进一步,应对更广泛的应用,实现更优异的图像质量。全新设计的光学器件和样品仓让您能够根据需要调整折射率。全新样品夹令安装更大的样品变得简单。智能软件工具帮助您调整各种成像参数,例如激光片层和样品位置、正确的缩放设置、拼图和多点以及数据处理参数。所有这些全新功能均与产生照明光片的柱面透镜和激光扫描这对可靠蔡司组合密切相关。Lightsheet 7还配备获专利的Pivot Scan扫描技术,以得到图像质量更好且无伪影的光学切片。

蔡司 Lightsheet 7 专用物镜
  • 观察真实生命活动--快速而灵敏

蔡司Lightsheet 7以pco.edge sCMOS检测器的高量子转换效率为特点,让您能够在较低的照明下就能观察快速变化的过程。这样,您便可以获得样品的实时图像,而不必担心激发光对它们的生理产生不良影响。对于垂直定向的样品和需要高帧率时,可以选择使用蔡司Axiocam 702 CMOS相机:特殊样品仓可提供加热、制冷功能,并可提供CO2,为您的实验维持合适的环境。它还配备 了多视角和同步触发选项,以控制外部设备。几乎任意范围内,Lightsheet 7是您实时观察生物体生命过程的理想系统。

 拟南芥花的发育图像
拟南芥花的发育图像-样品:图片由捷克共和国布尔诺市马萨里克大学中欧技术研究院(CEITEC)的S. Valuchova、P. Mikulkova和K. Riha提供

激光片层扫描显微系统的原理

激光片层荧光显微系统(LSFM)将荧光激发与检测分割成两个独立的光路,检测轴线与照明轴线垂直。也就是说,您可以同时照亮样品内部很薄的一个层面,只激发这一层面的荧光,从而产生一个内源性的光学切面。不需要针孔或者特殊的图像处理。来自于焦平面的荧光通过相机靶面一次成像,而不是像共聚集或者其他激光扫描显微镜那样逐点成像。与其它显微镜技术相比,基于相机靶面检测器的并行图像采集更快速,且所需的激发光强更小。总而言之,LSFM将光学切面效果与焦平面图像的并行采集相结合,令三维成像达到非常快的速度,且大大提高了光效率。

将检测光学器件从照明光学器件中分离出来,这样就能用低数值孔径的专用透镜进行荧光激发,而不会损失检测图像的分辨率和灵敏度。这使得LSFM成为毫米级样品成像的理想选择,例如,正在发育的生物体或者大型的透明化组织样品。

Lightsheet 7激光片层显微系统工作原理

Lightsheet 7的工作方法

 

观看视频,了解如何使用蔡司Lightsheet 7轻松定位并对样品成像。

获专利的蛇形扫描振镜

提供均匀的照明

当激光片层穿过样品时,一些诸如细胞核的样品结构会吸收或散射激发光。这样就会沿照明轴投射阴影,如左图所示。所有荧光显微镜都会出现这种现象,但在激光片层扫描显微技术中,因照明轴与观察轴垂直,所以这种效果更为明显。在Lightsheet 7中,获专利的Pivot Scanner技术可以在图像采集时向上或向下调节激光片层的角度。如右图所示,通过改变照明角度,让阴影投射到不同的方向上,激发光也将到达不透明结构后面的区域。因此,这款获专利的Pivot Scanner非常适合用于采集无伪影图像并改进下游处理和分析步骤,从源头开始处理伪影始终都是更好的做法。

蔡司Lightsheet 7应用实例

肾脏学

使用iDISCO+方法对小鼠肾脏进行透明化处理,并使用蔡司Lightsheet 7成像物镜5× / 0.16 foc和Clr 20× / 1.0 nd = 1.53(浸入)在肉桂酸乙酯中进行成像。使用DyLight 594耦合番茄凝集素灌注小鼠,从而标记血管和肾小球(红色)。绿色:组织结构的自发荧光。三维全器官成像和肾小球尺寸和数量的图像分析,有助于更好地了解各种肾脏疾病的机制,例如糖尿病性肾病。该图像在ACQUIFER HIVE上使用arivis Vision4D®处理。

 

样品由丹麦Gubra公司的U. Roostalu提供。

 

样品由丹麦Gubra公司的U. Roostalu提供。

发育生物学

P10小鼠气管的三维数据集显示了力敏感神经纤维的解剖结构。染色:DAPI,IV型胶原蛋白(Alexa 488 抗体),感官纤维(表达tdTomato的报告菌株,Alexa 555抗体),神经纤丝蛋白NF200(有髓鞘的神经纤维,Alexa 647抗体)。

用PEGASOS(Jing et al:, 2018, Cell Research)对样品进行透明化处理,在折射率为1.54的BB-PEG中,分别使用成像物镜5× / 0.16 foc和Cl r 20× / 1.0 nd = 1.53进行成像。5x物镜数据集:像素尺寸0.61 × 0.61 × 1.63微米,3×3拼图,放大1.5倍,1230个z截面,体积2.57 × 2.58 × 2 mm。20x物镜数据集:像素尺寸0.23 × 0.23 × 0.58微米,1×5拼图,放大1.0倍,4206个z截面,体积2.0 × 0.45 × 1.82 mm。

 

 

 
 

样品由德国柏林发育生物学/信号转导实验室的P.-L. Ruffault和C. Birchmeier;高级光学显微镜技术公司的A. Sporbert和M. Richter;以及德国柏林分子医学中心的M. Delbrück提供。

脊椎动物肢体、脊髓再生

蝾螈目动物具有奇异的四肢和脊髓再生能力。借助分子遗传学工具,可以识别促成这种复杂再生的干细胞,以及激发细胞增殖的创伤应激信号。此蝾螈的前臂已在肉桂酸乙酯中进行了透明化处理(Masselink, W. et al. Development 146, (2019)),并使用成像物镜5× / 0.16 foc以1.57的折射率进行成像。使用ZEN成像软件和arivis Vision4D®软件在ACQUIFER HIVE数据平台上对多拼图数据集进行校准、融合和渲染。

 

样品由分子病理学研究院(IMP)田中实验室的W. Masselink提供。
图片由奥地利维也纳IMP BioOptics公司的P. Pasierbek和K. Aumayr提供。

 

神经形态学

人脑中的神经元非常精密复杂,而且它们遍布于整个脑器官中,因此对人脑中的所有细胞进行成像是一项几乎不可能完成的任务。类器官可以在一定程度上再现人脑,包括从神经元干细胞培养中产生神经元。借助于ECi进行透明化处理,可以从局部到整体研究神经元形态学,为三维神经元形态的研究开创了极具吸引力的可能性。
35日龄的神经元类器官,使用GFP/ tdtomato(3% GFP和3% tdtomato)稀疏标记,并使用Clr 20× / 1.0 nd = 1.53物镜成像。
像素尺寸:222 × 222 × 567 nm。
图像体积:1.66 × 0.66 × 1.6 mm。

 

样品由奥地利维也纳分子生物技术研究所的. Reumann和J. Knoblich提供。

免疫学

对完整的淋巴器官进行三维成像,可以分析并量化淋巴对病毒感染的免疫反应。在采集之前,将T细胞转移至野生型宿主小鼠体内。使用Ce3D(Li et al. PNAS 163, 2017)对淋巴结进行清洁、固定和透明化处理,然后使用5× / 0.16成像物镜(体积2.5 × 2.5 × 1.6 mm)在1.49的折射率(ph 7)对其进行成像。图像显示GFP标记的初始CD8+ T细胞(黄色),B细胞滤泡用B220(青色)染色,血管网络用CD31(洋红色)染色。

小鼠淋腹股沟巴结

样品由澳大利亚亚帕克维尔区沃尔特及伊莱萨霍尔医学研究院的Joanna Groom提供。

整个鼠脑的血管图谱

使用PBS和4% PFA灌注一只C57 BL6J小鼠。脑部通过灌注Cell-Tracker™ CM-DiI染料进行染色,这是一种用于标记血管膜的脂类染料。使用iDISCO+方法对样品进行透明化处理,并以肉桂酸乙酯作为最终的折射率匹配溶液进行平衡。然后,使用Fluar 2.5× / 0.12成像物镜在Translucence介观尺度成像仓中,以RI=1.565的肉桂酸乙酯中进行成像。

右侧插入的高分辨率图像使用Clr Plan-Neofluar 20× / 1.0 Corr nd = 1.53采集。Image 图像体积为13.1 × 13.1 × 6 mm,像素分辨率为1.83 × 1.83 × 6.77 μm。在大约40分钟内以4×4拼图、866个z截面采集。数据量为93 GB。使用ZEN成像软件和arivis Vision4D®在ACQUIFER HIVE数据平台上处理数据。

 
 

样品由美国剑桥市哈佛大学的E. Diel和D. Richardson提供。

整个鼠脑的中间神经元和浦肯野细胞图谱

使用CLARITY方法对PV-tdtomato鼠脑进行透明化处理,并使用EasyIndex以1.46的折射率进行最终成像。
tdtomato-小清蛋白受Parvalbumin-Cre 控制,表达在大脑的中间神经元和小脑的浦肯野细胞中。脑部数据集使用5× / 0.16 foc成像物镜在蔡司Lightsheet 7上获取。图像体积为11 × 20 × 8.8 mm,像素分辨率为0.91 × 0.91 × 5.35 μm(12028 × 22149 × 1621体素)。以6×10拼图、1621个z截面采集。数据量为1.2 TB(拼接后为805 GB)。使用ZEN成像软件和arivis Vision4D®在ACQUIFER HIVE数据平台上处理数据。

 

样品由美国剑桥市哈佛大学的E. Diel和D. Richardson提供。

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蔡司Lightsheet 7

激光片层扫描显微系统,用于活体和透明化样品的多视角成像

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