蔡司冷冻关联工作流程

冷冻TEM薄片制备和冷冻体积成像的解决方案

由于细胞和组织的超微结构可以不带人为假象地保存下来，且细胞过程可以立即停止，因此冷冻显微镜可以在接近自然的状态下观察细胞结构。然而，冷冻显微镜技术却给用户带来了复杂的挑战，例如耗时的样本准备和成像流程、去玻璃化、冰晶污染或样本丢失 —— 如果想要将不同成像方式获取的数据关联起来，则会面临更多的挑战。

蔡司冷冻关联工作流程联接宽场显微镜、激光共聚焦显微镜和双束电镜，以实现体积成像和TEM薄片的高效制备。该解决方案提供了针对冷冻关联工作流程需求而优化的硬件和软件，从荧光大分子的定位到高衬度体积成像和用于冷冻电子断层成像的薄片减薄。

在接近自然的状态下成像

实现多种不同成像方式冷冻工作流程的无缝联接
保护样本，避免去玻璃化、冰晶污染或样本丢失
高分辨率荧光成像
高衬度体积成像和三维重构
有针对性的薄片减薄，用于冷冻TEM应用
多功能，可用于冷冻和室温应用

简化的工作流程让您能够专注于自己的研究

蔡司冷冻关联工作流程能够帮助您应对冷冻条件下联接不同成像方式的挑战。该工作流程可以联接光学显微镜和电子显微镜，从而实现体积成像和TEM薄片的高效制备。专用的配件简化了工作流程，并有助于在显微镜之间安全的传输冷冻样本。数据管理由蔡司联用软件ZEN Connect负责，对整个工作流程中获取的数据了如指掌。这一系列的工具都有助于增强成像效果。

双标记酵母细胞（CNM67-tdTomato和NUP-GFP），LSM图像（左）和Crossbeam图像（右）。样本由瑞士苏黎世联邦理工学院的M. Pilhofer提供。

优异的部件为您带来出色的数据质量

得益于冷冻兼容的物镜和Airyscan探测器的高灵敏度，蔡司LSM系统能够以高分辨率探测和定位蛋白质和细胞结构，同时温和的激光和恒定的低温条件可以防止样本去玻璃化。蔡司双束电镜提供了高衬度体积成像——甚至样本没有经过重金属染色。无论您是否进行TEM研究，这两种方式都为彻底研究超微结构提供了有价值的功能和结构信息。

多功能解决方案，让成像平台保持高效工作

不同于其他解决方案，该工作流程涉及的蔡司显微镜不仅可用于冷冻显微镜技术，也可用于室温的应用，这一点在显微镜不能完全用于冷冻实验的情况下尤其有益。将设备从冷冻状态转换为室温状态非常快速且无需专业技术。这种灵活性为用户提供了更多的实验时间。成像平台可以从更高的利用率和更快的投资回报中受益。

Core Imaging Facility with Cryo equipment

蔡司冷冻关联工作流程概览

优势

评估样本质量和防止样本损坏

样本丢失、冰晶污染和去玻璃化是冷冻显微镜技术领域众所熟知的问题。蔡司冷冻关联工作流程旨在保护珍贵的玻璃化样本，防止样本在这一艰巨的工作流程中产生许多潜在缺陷。

蔡司冷冻配件包结合蔡司共聚焦显微系统LSM/Airyscan和双束电镜Crossbeam的成像能力可降低在冷冻条件下工作时样本丢失或损坏的风险。

在该工作流程中管理样本之前，玻璃化本身就是一项挑战。虽然近来玻璃化技术取得发展进步，但样本通常仍覆盖在厚冰层之下或仅部分发生玻璃化转变，并形成非无定形冰区。玻璃化若不佳则会破坏细胞和组织的超微结构。除非您的光学显微镜或双束电镜提供在工作流程早期对样本进行评估的方法，否则只能在TEM中识别这些非无定形冰区。

蔡司共聚焦显微系统LSM系列通过启用不同的对比方法来提供这种评估功能。蔡司双束电镜Crossbeam还可以凭借出色的衬度性能可靠地评估样本质量，从而节省您的时间并提高实验效率。

承载玻璃化样本的HPF盖玻片（点击查看更多详情）; 图片提供：荷兰拉德堡德大学医学中心的 Anat Akiva 和 Nico Sommerdijk

承载玻璃化样本的TEM薄片（点击查看更多详情）

测量冰层厚度和高效定位ROI

测量冰层厚度对于判定样本质量以及定位玻璃化样本中的感兴趣细胞至关重要。通过光学显微镜可以轻松地验证样本。反射光成像和共聚焦荧光成像可以帮助您初步判定样本质量以及清楚定位可能的感兴趣细胞。

荧光信号呈现蜘蛛网状模糊图案通常表明样本冷冻不良。此外，急速冷冻样本会在同一份样本中呈现出差异化的冷冻质量和保存效果。掌握冰层厚度和冰层质量的信息可以在进行冷冻关联工作流程中的下个环节之前节省细胞预选的时间。

急速冷冻Hela细胞（Histone 2-GFP标记）反映了进一步成像的理想条件。冰层厚度约6.8μm，覆盖玻璃化细胞。这些样本非常适用于进一步的FIB-SEM分析。

解决方案概览

蔡司冷冻配件包

蔡司冷冻关联工作流程支持使用各种样本盖玻片：无论使用TEM薄片、AutoGrid、蓝宝石盘还是HPF样本皿，您都可以利用冷冻配件包轻松地装载、传输和储存样本。集成的各项功能和工具可以帮助您在整个工作流程中安全地处理样本。这些部件与以下设备兼容：

Linkam CMS196V³ 冷冻关联显微镜样本台
Quorum PP3010Z 冷冻传输系统

蔡司冷冻配件包

在蔡司双束电镜Crossbeam内部进行简便的样本传输和安全的样本处理

蔡司冷冻关联工作流程配置高度自动化且易于使用的气冷式冷冻制备传输系统Quorum PP3010Z。

涡轮分子泵冷冻制备腔室包括配备了用于受控自动升华和溅射镀膜的工具。
将玻璃化样本从直接连接至蔡司双束电镜Crossbeam腔室的冷冻制备腔室传输到一个高度稳定的冷台上进行成像和刻蚀。
冷冻制备腔室和Crossbeam腔室中的冷阱可保护样本免受冰晶污染。
CHE3010离机冷却系统确保连续冷却至少24小时。
Quorum的所有冷冻部件均由Prepdek®工作站控制，包括冷冻传输装置的真空储存仓和用于蔡司载样台的TEM制备储样仓。

蔡司双束电镜Crossbeam：可旋转冷冻辅台

结合非常可靠的成像方式

Cryogenic widefield and confocal microscopy

冷冻宽场显微镜和共聚焦显微镜：
ZEISS Axio Imager / ZEISS LSM 900/980 with Airyscan 2
与蔡司冷冻关联工作流程兼容的蔡司光学显微镜Axio Imager可配备Linkam CMS196V3冷冻样本台。根据您的要求，可以将Axio Imager配置为：

宽场系统（使用Apotome 3来获取三维数据集）
配有Airyscan 2的LSM 900/980，用于高分辨率共聚焦成像

该硬件旨在防止成像期间样本去玻璃化和冰晶污染。物镜放大倍率为5倍至100倍，支持从低倍放大概观图像到高分辨率成像。采用不同的光照方式（例如反射光或透射光模式）可以从不同的角度对样本进行研究，以获取有关冰层厚度和样本质量的更多信息。得益于灵敏的Airyscan探测器可提供非常温和的激光，使高分辨率冷冻成像成为可能。

LSM和宽场显微镜都是多功能工具，可以在不影响图像质量的前提下从冷冻实验快速转换为室温实验，反之亦然。

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Cryogenic SEM volume imaging and TEM lamella preparation

冷冻SEM体积成像和TEM薄片制备：
ZEISS Crossbeam 350/550/550L
FIB-SEM技术不仅成功应用于众多学科领域，同时在生命科学领域也占有一席之地，该技术可以用作切割生物样本的高精度工具，而且凭借其成像功能非常适用于分析超微结构。

蔡司Crossbeam旨在为您提供出色的可用性和优异的图像衬度。即使对于未染色的玻璃化样本，该FIB-SEM仍可在冷冻温度条件下提供高衬度图像，便于您研究细胞和组织的超微结构，使细胞结构清晰可见。

冷冻SEM成像需要在低加速电压下进行，但这往往会导致图像衬度低。蔡司Crossbeam即使在低加速电压下也能提供高衬度图像，这是得益于Gemini电子光学元件与探测器之间的良好相互作用。该配置还可以实时观察成像和刻蚀过程——您可以精准控制刻蚀过程，并确保对超薄TEM薄片进行有针对性的减薄。

蔡司Crossbeam可以用作多功能工具，不会影响性能。

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集成一体化：精心的软件包组合

为了确保简化的冷冻关联工作流程并确保各个部件无缝协作，对所涉及的各个软件平台进行了扩展，均支持冷冻应用相关的功能。此外，我们还开发了其他软件模块来解决冷冻关联显微镜带来的挑战。

蔡司ZEN
蔡司ZEN Connect
蔡司EM Processing Toolbox
SmartSEM and SmartFIB
Cryo Drift Reduction

蔡司ZEN Connect的冷冻关联数据集

应用

蔡司冷冻关联工作流程应用案例

细胞生物学：识别罕见事件

纺锤体极体难以在酵母细胞内定位，它们是微小且罕见的细胞结构。蔡司冷冻关联工作流程可以在接近自然的状态下精准识别此类细胞并进行成像。配有Airyscan探测器的LSM可以更容易地识别这些结构，从而提供更多细节的成像。ZEN Connect模块囊括了所有图像 —— 从整个细胞的概观图像到这些微小结构的高分辨率图像，提供在FIB-SEM中重新定位这些细胞结构所需的所有数据。

利用Crossbeam，可以制备已识别区域的TEM薄片，用于冷冻电子断层成像。而且还可以实现体积成像。此外，该工作流程解决方案可以在完成图像采集后将所有数据重新连接起来。可以将来自Crossbeam的图像或来自TEM的断层图像与LSM数据结合起来，并在三维环境中进行渲染。

用NUP（核孔复合物）-GFP和CNM67-tdTomato标记的酵母细胞
样本和断层图像由瑞士苏黎世联邦理工学院的M. Pilhofer提供。

LM和EM数据集 —— 从薄片概观到已识别感兴趣区域（用于进一步TEM断层成像的）

制备薄片的FIB图像；薄片厚度：230 nm

分割重构的断层图像

细胞生物学：关联三维体积成像

一旦LSM系统识别出了纺锤体极体等细胞结构，蔡司Crossbeam的优异成像质量即可通过冷冻体积成像来定位和分析超微结构。即使在低加速电压下，Crossbeam仍可对未染色的玻璃化样本进行高衬度成像，同时保护样本免受损坏。LSM采集的高分辨率图像和Crossbeam提供的高衬度图像有助于进行精准的图像叠加。使用ZEN Connect在Crossbeam中重新定位感兴趣区域后，即可获取已识别细胞的三维数据集。在关联体积成像中定位两个纺锤体极体。根据FIB的切割方向，可以在高衬度图像中清楚观察到各个微管的方向。可以在三维体积中识别其他细胞区室。

样本由瑞士苏黎世联邦理工学院的M. Pilhofer提供。

在冷冻条件下获取的高分辨率LSM/Airyscan图像与高衬度Crossbeam图像的叠加。利用ZEN Connect实现图像的叠加。

酵母细胞的三维体积重构，细胞核（深蓝色）分割，以及若干线粒体。

核膜内的纵切纺锤体极体（上部），核膜外的横切微管（下部）。所获取序列的图像步长：50 nm

癌症研究

癌细胞对线粒体分裂表现出很强的表型，这可能解释了癌细胞对药物的抗性。化学固定方法通常会产生伪影，例如线粒体的积累，这可能被误解为裂变事件。冷冻固定可以避免产生此类伪影，并使样本保持在接近自然状态。

该案例显示了在蓝宝石盘上急速冷冻的腺癌细胞。LSM数据已经明显反映出线粒体网络致密，裂变增加，之后这些现象得到Crossbeam数据的证实。经过LSM和Airyscan成像后，将玻璃化样本传输到Crossbeam中。ZEN Connect用于重新定位感兴趣区域，在采集后叠加各自的数据集，并整理所有采集的图像。

在蓝宝石盘上生长的急速冷冻腺癌细胞。所有感兴趣区域均在ZEN Connect中一览无遗。

一个腺癌细胞的三维数据集显示出强大的线粒体裂变模式。

Crossbeam数据集的子集中的线粒体自动分割网络。

植物科学

植物对不断变化的环境条件（例如盐度升高）的反应是植物科学领域的重要研究课题。在应对这些条件变化时，植物通常会表现出应激反应。可以在超微结构水平上观察到的一种效应是形成基质小管（从质体表面伸出的长管状结构）。

ZEN Connect项目模块显示了不同成像方式采集的图像：使用LSM通过样本的自发荧光来定位气孔和内化质体。成功重新定位感兴趣区域后，将LSM图像与选定气孔的SEM概观图像叠加。采集了气孔的FIB序列图像。EM数据集显示质体中的基质小管形成增加。

样品由德国霍恩海姆大学的 B. Franzisky 提供。

利用LSM，通过样本的自发荧光识别气孔和内化质体。重新定位选定的气孔，并用Crossbeam成像。

在用Crossbeam采集的切面图像中可以清楚地观察到基质小管。

FIB序列图像的三维重构和分割揭示了质体的形态。重构结果表明基质小管与线粒体紧密相互作用。

发育生物学：秀丽隐杆线虫中有丝分裂细胞的研究

用HPF固定秀丽隐杆线虫的全虫，通过冷冻荧光显微镜对中期胚胎细胞进行原位成像。然后通过冷冻替代对筛选出的线虫进行重金属染色、包埋和切片，以便可以用Crossbeam定位相同的位置并以高分辨率、高衬度对其进行成像。该工作流程可以成功地对目标中期细胞进行重构。此外，这种方法还可以获得意外的发现：值得关注的邻近点状荧光信号能够与假定的自噬体相关。

因此，高压冷冻厚样本的冷冻荧光显微镜可以用来捕获和成像接近自然状态的瞬时细胞结构；适当的处理以及后续的相关体积EM成像能够以高分辨率对这些目标结构进行三维重构。

样本由美国国家癌症研究所（NIH）和美国弗雷德里克国家癌症研究实验室的Kedar Narayan提供。