用结构照明进行三维荧光成像
蔡司Apotome.2背后的技术
在传统宽场荧光显微术中，图像包含着焦平面及其上下方的结构发出的光。焦平面上下方的结构发出的光在焦平面上可见是因为光的衍射和干涉。这造成了图像的模糊。衍射和干涉是物理现象。当他们发生时，光波相互作用，导致感兴趣的物体模糊。因此，一个小于分辨率极限的点在三维成像下，不会是一个点而是一个沙漏形状。这就是点扩散函数(PSF)。
1 um 小球的点扩散函数，分别使用物镜Plan-APOCHROMAT 20x / 0.80 (上图) 和Plan-APOCHROMAT 40x / 1.4 Oil
在研究厚样品时,焦平面外的光会增加图像中的背景荧光，从而降低图像的信噪比和对比度，进而导致图像质量下降。这样的图像通常不适合三维结构的分析和研究。因此,目的是消除焦平面外的光并得到较高的对比度和分辨率。这是光学切片的原理。除了主流的在光学共轭面使用针孔的共聚焦方法,其他方法，包括结构照明，已经得到足够发展，并能够获取光学切片。
网格决定了光学切片的厚度。
正如上面提到的,光学切片的主要目的是消除非焦平面的光以提高对比度。这通常会导致整体信号的降低。当弱荧光样品进行成像时，可以通过增加光学切片的厚度或增加曝光时间来克服这个问题。后者会给样品带来更高的负面作用：会导致样品漂白和光毒性增加,而前者会提高信噪比。所以光学成像时主要的权衡是降低信号,和操作者在信号、分辨率（比如光学切片厚度）、光毒性和曝光时间中作出的妥协。光学切片的厚度取决于使用的切片方法。
例如,在共焦激光扫描显微术中,针孔的大小决定了光学切片的厚度。扩大针孔会增加光学样品的厚度和整体的信号。光学切片的合理厚度也由物镜的数值孔径(NA)决定,因为更高的数值孔径会得到更薄的光学切片。在结构照明中，光学切片的厚度可以通过改变网格的频率来改变。这也意味着不同的数值孔径物镜需要不同的网格频率。
蔡司 Apotome.2
Apotome.2中的结构照明原理是基于宽场荧光显微镜焦平面的网格投影。随着网格横向移动,一定数量的图像（称作相位）被相机捕获。当照明网格线移动时，在焦平面上的结构发出的光,其强度会变化很大。如果结构不在焦平面上,移动的网格线不会导致发射光的强烈波动。通过计算不同相位图像之间的差异可以区分焦平面上和焦平面外的光。强度的差异是基于像素计算的，图像仅包含焦平面上的信息。