BRAIN Initiative

用Airyscan冷冻共聚焦成像

用蔡司LSM 8系列激光共聚焦显微镜和Airyscan在冷冻荧光显微术中获取更高的分辨率和信噪比

研究生物细胞和组织,不仅需要一个能够获取高分辨率图像的显微镜,还需要一种能将样品保存在接近生理或自然状态的制样技术。快速冷冻技术可以保存细胞的高含水量并把细胞固定在接近自然状态,然后通过荧光、电子或X射线显微术进行冷冻成像。相关冷冻荧光显微术的主要局限在于无法使用高数值孔径的油镜。

冷冻荧光成像下的盘基网柄菌细胞。样品由德国马丁雷德的普朗克研究所的生物化学系的Günther Gerisch博士提供。

冷冻荧光成像下的盘基网柄菌细胞。样品由德国马丁雷德的普朗克研究所的生物化学系的Günther Gerisch博士提供。

 

 

相比冷冻环境下的标准共聚焦图像,结合运用蔡司Airyscan技术的LSM 880和运用Linkam CMS196冷冻台的冷冻荧光成像,可以大大提升图像的分辨率和信噪比。蔡司的Airyscan技术以其前沿的共聚焦检测方法,能让用户甚至在不用油镜的条件下得到高质量的冷冻荧光数据。

电子显微镜网格上正在生长的细胞。各种类型的真核细胞都能够在用于电子显微镜的金样品支撑架上得以培养。

电子显微镜网格上正在生长的细胞。各种类型的真核细胞都能够在用于电子显微镜的金样品支撑架上得以培养。

 

 

像细胞这样的生物研究对象,主要由碳化合物和多达70%的水分组成。在研究自然的水性环境中细胞、组织的微细结构时,不仅需要一个可以获得高分辨率图像的显微镜, 还需要一种样品制备技术,避免任何可能发生的结构变化。玻璃化正是这样一种冷冻制备技术。它能够在几毫秒之内把细胞冷冻到大约-190° C以保存其高含水量。这个快速冷冻过程能够阻止水分子结晶,并形成一层玻璃样的非晶质冰将细胞结构保存在接近自然的状态。

将电镜网格上的细胞通过放入次级制冷剂(如乙烷)快速冷冻。快速冷冻使细胞玻璃化,并将其保存在非晶质冰中。

将电镜网格上的细胞通过放入次级制冷剂(如乙烷)快速冷冻。快速冷冻使细胞玻璃化,并将其保存在非晶质冰中。

 

 

在玻璃化前,细胞被培养在涂有碳薄膜的电子显微镜网格上。这些网格由一种无毒的材料(通常是金)制成。在冷冻的前一刻,残留的培养基或缓冲液被滤纸吸干,只留下一层很薄的液体膜,覆盖在电镜网格的细胞上。电镜网格随后迅速浸入次级制冷剂(如乙烷或丙烷),使细胞玻璃化。一旦冻结,样品需要时刻在液氮温度下保存。

冷冻荧光显微技术中的相关流程。

冷冻荧光显微技术中的相关流程。

 

冷冻荧光成像是一个相对较新的学科。它结合了冷冻制样方法带来的较好样品保护技术和生物结构荧光标记的优点。它在相关显微术中变得越来越流行。相关显微术会用荧光成像来找到细胞中感兴趣的区域或事件,然后再对这些区域或事件用电子显微术观察。相关冷冻成像的工作流程相比树脂包埋的工作流程的优点是,超微结构或者荧光基团得以很好的保存。冷冻的条件使得生物结构得以很好的保存,并增强了成像时的光稳定性。

在免费的蔡司操作说明书中,我们首次展示了对玻璃化样品的冷冻共聚焦Airyscan成像。数据表明,在冷冻条件下,即使没有油镜,也能用Airyscan得到比标准的共聚焦成像更高的分辨率和信噪比。

 

 

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